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实验背景
对分枝杆菌来说，因细胞壁结构特殊，阻碍了其在人和动物结核病诊断上的应用。选取已报道的布鲁氏菌和结核分枝杆菌16sRNA探针，通过改进样品处理方式、优化杂交条件，进一步简化操作步骤，同时利用本实验室保存的菌株和组织样品，对探针的特异性进行评价，最终建立了一个快速、准确的“两病”荧光原位杂交诊断方法。
实验步骤
将冷冻保存的布鲁氏菌株接种于布鲁氏菌液体培养基(BBL)，37℃培养2d;牛、禽结核分枝杆菌接种于罗氏培养基，37℃培养4周;回收培养物，PBS洗一遍，然后加入1% PFA溶液，混匀，4℃冰箱过夜。以上操作须在生物安全三级实验室进行，FPA固定后的步骤可在生物安全二级实验室进行。
将固定后的菌液用PBS洗两遍，然后涂布于载玻片上，风干待检。对布鲁氏菌，依次在30%、70%、100%乙醇中处理5 min，然后置阴凉处自然风干;加200μL杂交液，45℃杂交1.5~4h;用44℃预热的洗涤液洗涤2 min，双蒸水冲洗后，滴加抗荧光淬灭封片剂，镜检。对牛结核分枝杆菌，把样品在二甲苯中作用10~20 min后，依次在100%、70%、30%乙醇和PBS缓冲液中处理5min，用溶菌酶(1mg/mL)和消色肽酶(30U/mL)消化20min，然后分别在PBS以及30%、70%、100%乙醇中处理5min，风干;滴加杂交液，使用分子杂交炉(LF-IIIA，宁波jinnianhui金年会官网)于45℃杂交4 h，用37℃预热的洗涤液洗涤20min，最后封片镜检。对组织研磨液，短暂离心，取上清，PFA固定后涂片。对痰液样品，先涂片，再用PFA固定，杂交过程与上相同。
实验结果
布鲁氏菌：杂交前，对布鲁氏菌无需特别处理，45 ℃杂交1.5 h即出现红色荧光信号，200倍放大下观察，清晰可见(图1-A、B)。杂交3 h可完全满足检测需要，延长时间至8 h或12 h，信号强度不会明显增加，因而布鲁氏菌荧光原位杂交简便、快速，可在4 h内完成。Bru-996探针与布鲁氏菌S2、A19、Rev.1疫苗株和HN6、XJ-1分离株，均产生杂交信号，在牛结核分枝杆菌、禽结核分枝杆菌和大肠杆菌中没有观察到荧光信号，表明该探针具有较高的特异性。从5个已知布鲁氏菌病羊组织病料(2个肝脏、2个脾脏、1个胎盘)中均成功检测到布鲁氏菌(图1-C)，证明该方法具有较高的敏感性。在高倍放大下观察，布鲁氏菌呈短杆菌，小于大肠杆菌(图1-D)。
牛结核分歧杆菌牛结核分枝杆菌样品杂交前，须用二甲苯和溶菌酶处理（也可使用消色肽酶，但非必须），二者缺一不可。二甲苯需处理至少20 min，溶菌酶需消化30 min，以充分去除表面的酸类物质，从而获得充分的通透性，便于探针进入并与RNA杂交。45 ℃杂交4 h，可获得最佳效果，缩短杂交时间会影响信号强度。因此，牛结核分枝杆菌的检测时间较长，需6~8 h。从牛肺脏结核结节研磨液上清中，成功检测到牛分枝杆菌（图2-A），经抗酸染色检出较多的抗酸菌（图2-B）。结核病阳性牛鼻腔拭子中，未检出典型的牛结核分枝杆菌。
本研究建立了布鲁氏菌与结核分枝杆菌的荧光原位杂交快速检测方法。针对布鲁氏菌优化后实现4小时精准检测，Bru-996探针特异性强，可检出临床组织样本中病原体;牛结核分枝杆菌通过二甲苯脱脂与酶解预处理突破细胞壁屏障，6-8小时完成检测，与抗酸染色结果一致。该方法操作安全高效，为布鲁氏菌病和结核病的临床诊断提供了可靠技术支撑。
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